BAS-酶聯(lián)免疫試劑盒吸附試驗(yàn)(BAS-ELISA)是ELISA的一種改良技術(shù),將BAS,即生物素-親和素系統(tǒng)(biotinavidin system)引入ELISA,大大提高了ELISA的靈敏度。
一、親和素和生物素
1. 親和素(avidin) 給動(dòng)物飼喂大量卵白蛋白后,可引起生物素缺乏癥,此后證明,卵白蛋白中存在一種對(duì)生物素有異常親和力的堿性蛋白,稱之為抗生物素蛋白或卵白素,現(xiàn)今均稱為親和素。因?yàn)橛H和素存在于卵白蛋白中,故可從雞蛋白清中提取親和素,它是由四個(gè)相同的亞基組成的堿性糖蛋白,分子量6.6~6.8萬(wàn),等電點(diǎn)為10.5,由于每個(gè)亞基都可以結(jié)合一個(gè)生物素分子,所以親和素呈四價(jià)反應(yīng)性,在血清學(xué)反應(yīng)中,可以產(chǎn)生新的放大作用;現(xiàn)規(guī)定凡結(jié)合1μg生物素所需親和素的量,即為親和素的一個(gè)活性單位,1mg純親和素約含13~15個(gè)活性單位。
2. 生物素(biotin) 即維生素H,主要存在于卵黃、腎、肝等組織中,除可提取外,也能人工合成,另外在動(dòng)植物體內(nèi)也廣泛存在,系結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的小分子物質(zhì),分子量244.31,它不能直接與親和素結(jié)合,需活化后,產(chǎn)生生物素衍生物(即生物素酰羥基丁二酰亞胺,BNHS,為白色結(jié)晶,熔點(diǎn)200~202℃)才能與親和素結(jié)合。另外,它還能高比度地偶聯(lián)抗體等反應(yīng)物質(zhì)和酶等標(biāo)記材料,分別制成生物素化抗體和生物素化酶等,在免疫反應(yīng)中起到一級(jí)穩(wěn)定的放大作用。
因?yàn)橛H和素對(duì)生物素有*的特異性結(jié)合作用,且具有多價(jià)性,據(jù)此,可以建立生物素化抗體-親和素-生物素化酶復(fù)合物酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)體系,利用親和素為中介,一端通過(guò)生物素化抗體聯(lián)接檢測(cè)抗原的免疫反應(yīng)系統(tǒng),另一端通過(guò)生物素化酶等連接標(biāo)記顯示系統(tǒng),可產(chǎn)生多極放大作用,從而明顯地提高了檢測(cè)的特異性和敏感性。
二、BAS-酶聯(lián)免疫試劑盒吸附試驗(yàn)(BAS-ELISA)的技術(shù)類型 該檢測(cè)系統(tǒng)可分為以下兩類:
1. BAB法 (biotin-avidin-biotin) 即以游離的親和素分別橋聯(lián)生物素化抗體和生物素化酶的檢測(cè)方法。目前zui常用的是本法的改良法,即預(yù)先使親和素與生物素化酶形成復(fù)合物(avidin-biotin-peroxidase complex, ABC),再使其與生物素化抗體反應(yīng),因而叫做ABC法,此法既減少了反應(yīng)步驟,又因ABC網(wǎng)格結(jié)構(gòu)可網(wǎng)絡(luò)數(shù)量極為可觀的酶分子,從而使BAS的靈敏度又得到了進(jìn)一步的提高。
2. BA法 (Ab-biotin-avidin-HRP)即直接以酶標(biāo)親和素聯(lián)接生物素化抗體,檢測(cè)抗原的方法。
為簡(jiǎn)化反應(yīng)程序,廠家試制了酶聯(lián)BAS試劑,連接被檢測(cè)的免疫反應(yīng)系統(tǒng)是生物素化抗體,即生物素化抗抗體-羊抗兔(SARG-b)和兔抗小鼠(RAMG-b)及一種生物素化抗體-生物素化馬抗人AFp。較常用的生物素化酶是生物素化辣根過(guò)氧化物酶(bHRP)。
三、(三) BAS-ELISA在檢測(cè)工作中的應(yīng)用 該技術(shù)應(yīng)用zui多的一個(gè)方面是檢測(cè)可溶性抗原如細(xì)菌和病毒等,以及它們的相應(yīng)抗體,現(xiàn)舉例如下:
1. 細(xì)菌性抗原的檢測(cè) Yolken等采用雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測(cè)流感桿菌b型、肺炎球菌和鏈球菌抗原等,先用相應(yīng)抗體包被酶標(biāo)板,然后分別加入細(xì)菌培養(yǎng)上清液、生物素化抗體和親和素與生物素化酶復(fù)合物來(lái)實(shí)施反應(yīng);本法檢測(cè)的靈敏度比常規(guī)ELISA和熒光抗體法高4~16倍。2. 病毒性抗原的檢測(cè)病毒性抗原也可用雙抗體夾心法檢測(cè),如檢出糞便中的輪狀病毒,可用抗體包板,再相繼加入待檢標(biāo)本、生物素化抗體、親和素和3H標(biāo)記的生物素,然后作放射免疫測(cè)定。國(guó)內(nèi)已用BAS-酶聯(lián)免疫試劑盒吸附試驗(yàn)檢測(cè)單純皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、肺炎病毒及其相應(yīng)抗體。
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