◎ELISA實驗的結果受操作影響很大，每個步驟包括加樣，溫育，洗滌，顯色，酶標儀讀數均應認真負責才能充分發揮ELISA的高靈敏，強特異的優點。
◎因此,應建立實驗項目的標準操作程序（SOP）。
加樣
◎加樣應用微量移液器（加樣槍）按規定的量加入微孔板的1/3處避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產生氣泡。
◎每次加樣應更換吸嘴，做到一人一吸頭，以免發生交叉污染;干吸頭預先在血清中抽吸三次。
◎樣本稀釋，目的是為了減少非特異性反應，所以一定要先加稀釋液后加樣本，特別注意加樣后要在微量振蕩器上振蕩30秒鐘，同時注意防止液體溢出。如后面操作步驟中加二種以上試劑時均需振蕩混勻。
◎如用滴瓶滴加試劑應先將滴瓶搖勻并擠去*滴有氣泡的試劑后加樣。
溫育
◎抗原抗體反應需要在一定溫度下（37°C），經過一定的時間才能達到反應的平衡點
◎ELISA邊緣效應是由溫育形成的。所以溫育一般采用能 使反應液溫度迅速達到平衡的水浴法。一種放在水浴箱的隔板上，另一種是放在溫箱的濕盒里。水要浸至板條的1/3處，不可將板條疊加放置。
◎邊緣效應（2ng/mlHBsAg一步法三種不同溫育法的結果）
洗滌
◎ELISA是靠洗滌來達到分離結合與未結合抗原抗體復合物及酶標記物的目的，同時洗滌也可將非特異吸附的蛋白質的干擾以及血球、細菌中的酶干擾清除掉。
◎手工洗滌一般采用浸泡方法：1）甩去孔內反應液；
2）用洗滌液過洗一遍（即注滿孔后即甩去）；
3）微孔重新注滿洗液后浸泡2-3分鐘，間歇搖動；
4）甩去孔內液體，拍板，用紙吸干。
重復以上操作至少5次。注意各種ELISA試劑盒的洗滌液盡量不要混用。
◎洗板機洗板一定要預先把板架放平，使洗板機上的每個放液和吸液纖孔都能一致地插入孔底，將孔內液體全部吸干，同時要設置一定的浸泡時間。如出現機洗后拍板有較多殘留液時應再用手工洗2次以上。關機前要用蒸溜水沖洗管道，避免堵孔。
顯色
◎HRP催化底物的一步呈色反應，同樣需要一定的時間和溫度，
◎ 一定要按照說明書規定的時間溫度（一般為37°C，10-15分鐘）恒定反應后終止
◎或根據臨界值質控血清吸光度值達0.2左右使的時間而恒定反應時間.
酶標儀判讀結果
◎顯色反應終止后應立刻比色（30分鐘內）。
常見的顯色系統有OPD和TMB二種，以后者zui為常見，而TMB酸不易終止因此必須盡快比色以免影響結果。OPD終止后顯棕色，測定波長為490nm；
TMB終止后顯，測定波長為450nm，
二種底物的校正波長均用630nm。
使用雙波長的優點可以消除反應板條上的劃痕手印的干擾。同時要注意反應板應用紙吸干后才能置酶標儀中比色，否則吸光度易出現負值或損壞濾光片。
報告方式
◎定性試驗 國內外為便于統一計算，一律按S/C.O方式報告，S為標本A值，C.O即Cut Off值（陽性判定值）
◎夾心法和間接法以S/C.O≥1為陽性；
竟爭法與中和法以S/C.O﹤1為陽性
◎Cut Off的計算公式以ELISA試劑盒說明書的為準常見的有：
◎A） C.O=2.1×N（當N不足0.05時按0.05計），
◎此公式由P/N>2.1換算而來，常用于夾心法。
◎B） C.O=0.5×N，從抑止率公式換算而來，
◎常用于竟爭，中和法
◎C） C.O=N+C（C為常數），用于間接法。
◎D） C.O=C×P+N（C為常數），用于間接法。此公式zui客觀，但對生產廠家要求很高，陰陽性對照測定值要基本恒定。
定量分析 用已知量的標準品作一系列稀釋，ELISA測定，繪制標準曲線，結果以量或單位表示。
ELISA的標準曲線每次都要和待測標本做在同一塊板上。
◎現有的ELISA定量試劑盒標準曲線只有在較窄的濃度范圍內成直線，要得到的結果實屬不易。
因此嚴禁用定性試劑盒做定量分析。
灰區概念
把定量分析的正常值范圍引入定性分析建立灰區概念，即將CO值上下的一段區域定為陽性可疑，需重復實驗或換試劑重測以確定其陰陽性，如仍落在灰區范圍內則報告+（陽性）。
灰區概念對血站系統的獻血員篩查尤為重要。
灰區的設置有二種：
1）C.O×（1±CV），
CV為該試劑的批內CV （一般在15-20%間）；
2）C.O±2s，s為實驗室做室內質控ROC的s。
高值鉤鐮效應（HD-HOOK）
◎在二位點夾心ELISA中，其劑量反應曲線的高劑量（HIGH DOSE，HD）區段，線性走向不是呈平臺狀無限后延，而是向下彎曲狀，似一只鉤子或一把鐮刀（HOOK），MILES（1974） 根據此現象寫實性地稱之為"HD-HOOK"效應。產生該現象的分子機理有"分子變構說"和"濃度效應"等推論。
◎一步法和二步法均存在， 只是前者出現的更早些，大多數是高值低吸光度，很少陰性結果。
