一、為達到免疫組織化學技術(shù)的要求,組織固定越新鮮越好。
在免疫組化zui后結(jié)果的判斷時,常可見到均勻一片的似非特異性染色的現(xiàn)象,經(jīng)多方研究認為,它是一種假性非特異性的染色。因為腫瘤組織中含有的抗原較易發(fā)生擴散彌散,腫瘤細胞無限制的生長和生長過速,導致腫瘤中間部分組織血液供給困難,造成缺血壞死,壞死細胞中的抗原由于機體的作用,可以被均勻地散布于細胞與細胞間的間質(zhì),這是抗原發(fā)生彌散的一種方式。另一種抗原彌散的方式就是,由于組織沒有及時的固定所引起的。離體的組織不及時固定,組織就會自溶,抗原就會擴散,這是一非常普通的常識,但要做好卻是極不容易。標本從外科切除到浸入固定液需要經(jīng)過一段時間,在這段時間里,有的抗原就可以發(fā)生擴散。雖然已浸入了固定液,但標本較大,固定液的量又不足,當然由于固定液的滲透需要時間,當滲入到組織之中時,中間的細胞已發(fā)生了變化,抗原也隨著發(fā)生擴散,這種現(xiàn)象在產(chǎn)酶多的器官是比較明顯的,如胃癌,當切除后標本較大,雖然在手術(shù)室期間已放入了固定液,但固定液要透過肌層達到胃粘膜面起碼需要幾個小時的時間,當固定液發(fā)揮作用時,組織已經(jīng)發(fā)生變化。因此,這了達到免疫組織化學染色的要求,對于離體的組織盡量快的進行固定,有條件的應(yīng)將其剖開,早取材,早固定。
二、組織脫水必須*干凈
組織塊取材不能太大過厚,才能較好地完成脫水的過程。如果取材太厚,在較短的時間內(nèi)脫水不*,將可引起一系列的問題,比如浸蠟不*,切片不好完成,切不完整。由于先天不足,導致后來切片染色的脫落,造成染色的失敗,或者由此反復操作,造成年人力物力的浪費,造成病理報告的延期發(fā)出等。因此,對取材的要求是除了要求要有藝術(shù)性外,即平整、外觀好看,還要求適中。
三、切片必須完整、均勻、平展、無鄒折
應(yīng)用于免疫組織化學染色的切片,對切片的質(zhì)量要求較高,切片必須完整,平展、無汽泡,無鄒折,這樣有利在染色時的沖洗,有利于切片的牢固附貼。如果切片不平展,免疫組化染色后,可出現(xiàn)染色不均勻的現(xiàn)象,顏色深淺不一, 不平。如果切片有汽泡切片在烘烤時,由于汽泡的破裂影響了汽泡周圍的組織,在其周圍可觀察到深淺不一的染色。如果切片有鄒折,免疫組化染色后,在鄒折的地方有深淺不一的顏色,這是一種假陽性,容易引走混淆。
四、切片的附貼必須牢固,必須使用合適的粘貼劑。
免疫組織化學染色前的前期準備工作,就是必須對新的載玻片進行處理,新的載玻片表面看起來很干凈,有人認為不需要進行任何的處理,都能夠適合使用,這是一種錯誤的想法。新出廠的載玻片,表面復蓋著開一層油脂樣的物質(zhì),如果不加以處理,對切片的附貼是極為不利的。我們的做法是:新的載玻片,放于玻璃清洗液中浸泡4小時甚至過夜,然后取出,經(jīng)自來水*沖洗后,浸入酒精中達2小時以上,取出擦干備用或烘干也可。然后再將載玻片浸入了-氨基-三乙氧基-硅烷(3-Aminopropyl triethoxy-silane)的稀釋液(1:50用丙酮或無水乙醇稀釋都可以)中硅化10分鐘,后經(jīng)無水乙醇洗2次,烘干即可使用。
五、切片必須烘烤附貼牢固,既要經(jīng)得起抗原修復時高溫的作用而不使輕易脫片,又不至于破壞抗原。
應(yīng)用于免疫組化染色的切片。由于整個過程需經(jīng)幾個階段的處理,如抗原修復時抗原修復液的沸騰且需持續(xù)十幾分鐘,PBS的反復沖洗,有的甚至于4℃冰箱中孵育達十幾小時。因此,對切片的質(zhì)量要求很高,尤其是切片的附貼程度。以往有人主張切片在60℃以下烘烤30-60分鐘即可按此進行結(jié)果是切片掉片嚴重,切片松動率占100%。切片究竟烘烤多長時間才合適,既不脫片和適合各項要求,又不至于破壞抗原。幾組實驗[]診斷P173認為,切片在60℃的恒溫干燥箱中烘烤2-5小時zui為合適。這是因為:抗原可耐受如此的溫度,病理科一般使用的石蠟,其熔點在60℃左右,組織浸蠟時,浸蠟箱中的溫度,一般都調(diào)在65℃左右,組織在這樣溫度中要浸泡2小時以上,才能達到*地浸蠟。組織中的抗原已經(jīng)受了65℃的溫度考驗,保存下來的抗原,都已具有耐熱性。另外,經(jīng)上述時間烘烤出來的切片,附貼牢固,抗原保存好,染色成功率達100%,保證了病理診斷的及時性和準確性。
特需要注意的是,不管是應(yīng)用于診斷的切片還是研究用的切片,烘烤后應(yīng)盡快進行染色。如果切片切完后,遲遲不進行染色,存放于室溫中或工作冰箱中,切片中的抗原將會隨著時間的延長而逐漸消失,甚至出現(xiàn)假陰性。原則上是新鮮切片,即行染色,染多少張切多少張,這樣才能盡可能的保存表達更多的抗原。
六、切片脫蠟必須干凈,否則將會影響免疫組化染色的zui后結(jié)果。
蠟不溶于水,不與其它的臨床使用的抗體相融合。它只能靠特用的試劑,處理足夠的時間,才能將其除去。如果脫蠟不干凈,少許蠟存留于切片上,將會引起許多弊病,如染色不均勻,陽性物時隱時現(xiàn),真假難辨,背景染色增加等。為了解決上述的問題,切片在染色前必須*脫蠟,目前用于脫蠟的試劑主要是二甲苯,因它脫蠟力強,脫蠟時間較短。較受使用者的青睞。脫蠟的時間要根據(jù)季節(jié),室溫和試劑的新鮮謀面是在不同。如果在夏天,室溫較高,脫蠟試劑也新鮮,則脫蠟時間不需很多,3-5分鐘就已足夠。如果在冬天,室溫較低,脫蠟試劑也較陳舊,則脫蠟時間需要延長,10-20分鐘或更長。總之,操作時應(yīng)根據(jù)不同的季節(jié),不同的室溫,不同的試劑來決定,脫蠟的時間,原則上是要*,干凈,*地脫去切片上的蠟。為了做到這一步,切片在脫蠟前的加溫將有助于完成上述的要求。比如:當天切的切片,燒烤2小時后進行染色,切片帶有溫度進行脫蠟這將可加速脫蠟的過程,如果預(yù)先切好烤好的切片,在染色前,還必須對切片進行加溫10-20分鐘,然后再行脫蠟,這樣脫蠟速度加快,效果魁偉更好。
七、必須*抑制內(nèi)源性過氧化物酶的活性,才能降低背景的染色。
在各種組織中都含有很多的內(nèi)源性過氧化物酶,尤其在紅細胞,中性粒細胞,單核細胞嗜酸性細胞,出血的組織壞死的組織等等。含有這種酶的各細胞和組織如果在染色前不對其進行處理和抑制,它們將會在DAB底物的顯色時,與HRP一樣催化底樣,使之顯色,使之生成與陽性物一樣的黃棕色,造成混亂。為止,在免疫組化染色前,都必須對內(nèi)源性過氧化物酶進行抑制。當然,對它們進行*的消除是不行的,因為抑制太厲害,對抗原也會有相同的抑制作用。氫在抑制內(nèi)源性過氧化物酶時,也要注意對抗原的保護抑制也只能對它們中的大部分在DAB顯色后,顯示出淡黃*色,這就足以與真正陽性物的區(qū)別。抑制劑常用的是0.3%的H2O2,也可將其稱為1%H2O2,因為市售的H2O2的濃度為30%,按其凈含量則為0.3%,如果按其溶液的用量則為1%。
關(guān)于H2O2的使用,有的使用是單純的H2O2稀釋溶,有的使用是H2O2甲醇混合 物。根據(jù)實驗,認為H2O2甲醇較適合于大多數(shù)的情況,因為除了H2O2外,甲醇對各種酶,都有鈍化的作用,因此H2O2甲醇的雙重作用效果較好。陳尚平等認為在多數(shù)情況中,用甲醇H2O2已經(jīng)獲得令人滿意的結(jié)果。
八、須適當合理地使用封閉試劑
為了減少背景產(chǎn)生的非特異性染色,在免疫組化染色的過程中,在加入一抗孵育前,常常加入非免疫動物血清,以減少背景的染色,陳尚季等認為:抗體是高度的電荷分子,可能與帶有相應(yīng)電荷的組織成分無特異性地結(jié)合(如膠原)。由于這種非特異性結(jié)合,將導致標記的部分局部化(軛合物)和膠原的假陽性染色。要用一種不相干的抗體居先處理,可能減少和標記的抗體無特異性結(jié)合。
以往,血清的使用有很多,如:小牛血清,馬血清,山羊血清,綿羊血清,兔血清,濃度也有很多種,如:1%.2%.或1:5、1:10、和1:20.
必須選擇合適的抗體以及對作適當?shù)谋4婧团渲啤?br />
九、選擇合適的抗體
至今為止,應(yīng)用于臨床的常用抗體有幾十種,在這當中又可分為兩種類型。
1.濃縮型抗體
根據(jù)近幾年來使用的情況認為,它有許多優(yōu)點,但也有許多不足之處:
①可作為各種疾病檢測的常備抗體。在各單位的常規(guī)活檢診斷中,有常見的病例,也有罕見的病例,尤其是后者,有時很長時間才遇到一例,這就給抗體的應(yīng)用和備用提出了更高的要求,如除了常用的抗體外,還需備用一些較為罕見病例的抗體。這樣才能解決臨床的診斷問題,如臨時購買,則需較長的時間,這樣就會延誤診斷。實踐證明:濃縮型抗體,可作為常備檢測抗體。當購買抗體后,根據(jù)檢測病例的數(shù)量,在無菌的條件下,將抗體分成小包裝,然后用蠟?zāi)し馄饋恚冢?0℃的低溫冰箱中保存,臨用時取出一支,用指溫促其回升至室溫,然后用PBS稀釋即可使用,這種抗體可保存3年左右。
②成本低,價格較便宜。
它與即用型的抗體相比較,價格要便宜好多,如以某公司2002年-2003年的CK為例,濃縮型的抗體0.1ml,價格260元,該抗體可稀釋為5000ml,以每張切片所需抗體為50ul計,可標記100例,每例一抗體所需2.6元,而即用型抗體1.5ml,價格150元,可標記30例,每例一抗體需5元。
③需要稀釋抗體,手續(xù)較為復雜。 對于新購入的濃縮型的抗體,使用時必須將稀釋為工作液,才能使用,對于從未用過的抗體,還必須實驗其實際的稀釋度,因為各種抗體,廠家都做了相應(yīng)的稀釋度的實驗,但這是大概的稀釋度,要使抗體真正適合于本單位的稀釋度,就必須對抗體的稀釋度進行實驗,如1:100.1:75.1:50.1:25等,如果結(jié)果在1:50上是*結(jié)果,這就是*的稀釋點,如果在這范圍內(nèi)找不出*稀釋點,則應(yīng)繼續(xù)實驗直到找出*稀釋點為止。
④需要配置各型號的微量加樣器,以利于量取的抗體量。
⑤需要具備一定的英語水平,因為濃縮型的抗體多為進口試劑,其使用書都以英文為主,其中涉入抗體的來源,適應(yīng)讓稀釋對什么組織或細胞可起反應(yīng)等。
2.即用型抗體。
近幾年來,免疫組化技術(shù)應(yīng)用的推廣,即用型抗體的應(yīng)用越來越受到人們的歡迎,根據(jù)幾年來的使用,認為它有許多優(yōu)點和不足:
①使用方便。對于初學者來說,它是一種的抗體,不管什么樣的病例和切片,只要有抗體,不需要自己摸索稀釋度,拿起試劑瓶一滴即可,極不方便。
②對于不具備或基本不懂免疫組化技術(shù)的人,只要按照說明書的方法使用,也能獲得理想的結(jié)果。
③不需要配置多種昂貴的微量加樣器。現(xiàn)今的微量加樣器,如為進口貨,貴者多達兩千多元。而即用型抗體無需再行稀釋,即買即用,無需配備其余器械。
④特別適合于基層單位。基層單位,無需多大的投資,就能開展免疫組化的工作,這對于提高診斷的準確率,極有好處。
⑤價格較濃縮型抗體貴。
⑥即用型抗體不可作為常備貯存抗體。即用型抗體,一般有效期為一年。如果用量大的單位,對于3ml一個包裝的抗體,一年需要用幾支,這對抗體來說,不會造成浪費。但如果為較小的單位,一年中標記的病例較少,購買抗體時也盡量選小包裝的抗體,如1.5ml。如果碰上罕見的病例,有時一年也標記不了幾例,這樣就應(yīng)采用濃縮的了。即用型的抗體,有效期為一年,但真正購買到的抗體使用期就不可能為一年,因為抗體從生產(chǎn)商到銷售商的手里,需要一定的時間,如果運氣好的話,你購買到的抗體,是剛交到銷售商的手里,那么,使用的時間可能長些,但如果在銷售商的手中滯留了一段時間,抗體的有效使用期就可能不會太長,五個月、六個月或者三個月。如果在有效的時間內(nèi)不能使用完。稍為超過一些時間還可以,如果時間過長,就應(yīng)當丟棄,因為會影響標記的質(zhì)量。有人抱怨,剛買的抗體標記很好,后來就漸漸不好了。這是因為隨著時間的延長,抗體的活性會逐漸失去生物活性,導致了標記質(zhì)量的下降。
(2) 抗體的適應(yīng)癥。
在眾多的抗體中,按它們的實際使用范圍,把它們分為兩個類:
1.適合于冰凍切片,涂片,細胞培養(yǎng)片。
2.適合于石蠟切片,冰凍切片,涂片和細胞培養(yǎng)片。
(3)選擇合適的單克隆或多克隆抗體。
抗體除了分為上述的兩個類外,從其克隆的高度講,也有單克隆和多克隆之分。
1.單克隆抗體,在目前臨床常用的抗體當中,大部分都是單克隆抗體。這要歸功于生物技術(shù)的不斷提高。在早些時候,應(yīng)用于臨床的抗體,大多數(shù)為多克隆抗體。
2.多克隆抗體,在臨床應(yīng)用的抗體中,還有少部分的抗體為多克隆抗體。
(4)抗體的加入。
這看似很簡單的問題,如果處理不好也可導致不同的結(jié)果,如果應(yīng)用自動免疫組織化學染色儀,將程序輸入即可,如為手工操作,就必須注意以下的問題:
1.當PBS沖洗完畢后,在加入抗體,如一抗,二抗或三抗。必須將存留于切片上的多余的PBS摔干,但不能讓切片干涸,切片干涸,往往可產(chǎn)生非特異性染色,切片上PBS存留過多,將會稀釋加入的抗體,影響加入抗體的濃度,同時也將影響zui后的結(jié)果,如假陰性等。
2.加入的抗體以一滴為佳。
當擦干組織塊周邊多余的PBS后,切片保持著一定的濕潤度,此時加入另外的抗體為*時候,滴入抗體以一滴50ml為好,加入后,輕微地搖勻地覆蓋于切片上,使zui后的結(jié)果穩(wěn)定均衡,不至于有的地方有反應(yīng),有的地方無反應(yīng)。
3.切片沒擦好將會影響加入抗體的質(zhì)量,切片沒沖洗干凈,沒擦試好,當加入抗體后,它可縮于切片的一邊,此時你為了使加入的抗體能夠*地覆蓋整個切片,便會使勁地加入抗體,此時的結(jié)果是,抗體依然滑向一邊,或者*露出,這不光沒達到目的,還浪費抗體,正確的做法就是*地用PBS沖洗,摔干切片擦干切片周邊的PBS,再滴入一滴抗體輕輕搖勻即可。
(5)選擇合適的孵育時間。
*抗體的孵育時間,有較多的使用范圍,應(yīng)用于臨床檢測抗體的孵育時間。一般室溫下孵育在30-60分鐘,120分鐘,對于研究性質(zhì)的抗體孵育時間,也可按照上述的時間,但也有人提出于4℃冰箱中過夜孵育,根據(jù)我們的經(jīng)驗一般不主張于4℃冰箱中過夜,原因是:
1.長時間的孵育可以使一些非特異性的物質(zhì)沉淀下來,或者被吸附,造成背景的染色。
2.目前銷售的抗體,純度較高,特異性較強,不需要長時間的孵育,也能夠結(jié)合得很好 。
3.長時間的孵育,較容易引起切片的脫落,造成染色的失敗。
4.長時間的孵育,不利于臨床病理報告的發(fā)出。
十、連接抗體的選用必須正確,否則可造成假陰性的現(xiàn)象。
免疫組化染色方法較多,如ABC法,SP法和EV二步法等,如果使用的是SP法,或者ABC法,這時就必須要仔細地選擇好連接抗體,*抗體有單克和多克隆炎分,連接抗體則要根據(jù)選用的抗體來進行,例如:*抗體選用的是單克隆鼠抗人**抗體,連接抗體也要選擇相應(yīng)的免抗鼠IgG,這樣才能連接上(目前生產(chǎn)廠家已生產(chǎn)出混合型抗體,即既適合于單克隆抗體,也適合于多克隆抗體。使用者不用擔心連接不上,隨便使用都可,但如果沒有訂購混合型的試劑盒,就必須注意的型號,使之*適合所選用的抗體。)孵育的時間可在10分鐘,20分鐘或者30分鐘,一般在室溫中進行,如果室溫低于20℃以下,則可在37℃的孵育箱中進行。
十一、復合物的使用及孵育時間的確定。
各種方法有各自的復合物,如ABC法,復合物是卵白素和生物素結(jié)合的復合物,再帶有HRP,SP法,(LsAB法)的復合物是鏈雪菌素蛋白復合物,再帶有HRP,EV二步法的復合物則是二抗和三抗連接在一起的復合物,再帶上HRP,除此之外,根據(jù)水解底物的不同,可產(chǎn)生不同的顏色,例如:帶有HRP的酶,水解的底物一般為DAB產(chǎn)生黃棕色,帶AP的酶,水解的底物一般為AEC產(chǎn)生紅色。
十二、PBS的沖洗
免疫組化的染色過程,除了前面的處理和加入的抗體外,都在PBS的沖沖洗洗中度過,PBS沖洗的正確與否,也是導致zui后結(jié)果的關(guān)鍵。
1.單獨沖洗,防止交叉反應(yīng)造成污染。
臨床上每天檢測的病例很多,所用的抗體種類及項目也多,如果在加入一抗孵育完后,將它們在一個缸內(nèi)洗,這樣就會造成交叉污染,影響zui后的結(jié)果。正確的做法是單獨地進行沖洗,沖洗的PBS為一次性,保證切片沒有相互交叉污染的機會。
2.溫柔沖洗,防止切片的脫落。
沖洗切片,取出切片,將PBS從上輕輕地沖洗,讓PBS自上而下流下來,不要拿起切片將PBS對準切片沖洗,這樣由于沖出的PBS有一定的沖擊力,很容易使切片周邊引起松動,導致切片的脫落。
3.沖洗的時間要足夠,才能*洗去結(jié)合的物質(zhì)。
沖洗切片有人提出用微振蕩器振染,振下未結(jié)合的各種物,使之不產(chǎn)生背景,此種做法一是浪費時間,二是很容易導致切片的脫落。切片的沖洗據(jù)實踐認為,用一小燒杯柔和地于切片上沖洗,就能*沖洗去未結(jié)合的物質(zhì),無需附加其它條件,沖洗好于切片上再注入PBS,持續(xù)2分鐘左右就*足夠了。
4.PBS的PH和離子強度的使用和要求。
劉彥仿指出:中性及弱鹼性條件(PH7-8)有利于免疫復合物的形成,而酸性條件則有利于分解;低離子強度有利于免疫復合物的形成,而高離子強度則有利于分解。[]免疫組化P56我們目前常用的PBS的PH在7.4-7.6濃度是0.01M,根據(jù)本室十幾年來的使用情況,認為該溶液價格便宜配制方面,使用效果好。
5.常用試劑的配制和使用。
在免疫組織化學的染色過程中,用得zui多的試劑就是緩沖液,因為切片在整個染色中,抗體的加,換,切片的沖洗,DAB的配制都離不開緩沖液。可見緩沖液在整個染色中都起至關(guān)鍵的作用,緩沖液的過酸或偏堿,都將影響染色的結(jié)果。下面將介紹有關(guān)方面的內(nèi)容:
(1)緩沖液的配制
1.磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffer solution.PBS)
Ⅰ液:0.2M Na H2PO4貯存液(PH7.6)
取一個具500ml的容量瓶,稱量15.60g NaH2PO4﹒12H2O倒入瓶中,加入少量蒸餾水使勁搖晃,直至溶解,加入蒸餾水湊足500ml。放于4 冰箱保存,配制時應(yīng)注意的事項:
①在配制時,要先確定NaH2PO4的用量,因為該試劑有許多種類形,它們所含的水分子量不一樣,因而它們的用量也不一樣。如NaH2PO4含單個水分子時,配制時要稱取13.80g,而當含有2個水分子時,則需要稱取15.60g。
②配制時根據(jù)要求選取蒸餾水。因為蒸餾水有數(shù)種,單蒸餾水,雙蒸餾水,玻璃蒸餾水,去離子水。如沒特別要求,選用一般的蒸餾水配制則可。
③裝緩沖液的瓶子須用玻璃浸洗液泡洗過,以防污染,導致溶液中有雪菌生長。
Ⅱ液:0.2M NaHPO4貯存液(HP7.6)
取500ml的容量瓶,稱好17.91g NaHPO4﹒12H2O,倒入瓶中,邊加水邊攪拌,直至*溶解再湊足500ml,貯存于4℃冰箱。
注意事項:
①該試劑也應(yīng)注意有多種不同的含水分子量。
②該貯存液久放后可出現(xiàn)結(jié)晶。每次使用前,先取出回至室溫,搖晃其結(jié)晶溶解,也可用微波爐促其快速溶解,然后再用。
0.01M PBS工作液的配制:
取一2000ml的容量瓶一個,裝入已稱好的NaCt18g,加入少量蒸餾水讓其*溶解,再加入 Ⅰ液13ml,Ⅱ液87ml,加蒸餾水湊足2000ml,即可使用,即可使用該溶液在室溫下可保存3-4周,但以新配為佳。
PBS工作液配制完畢后,都要測其PH值,如果偏酸,可用氫氧化鈉來調(diào)試,如果偏堿可用HCl調(diào)試,測試有如下n種方法:
①PH測試筆測試,這是一種簡便、易行、結(jié)果較為準確的測試方法。當配制完P(guān)BS后,取一小杯,倒入配好的PBS,插入測試筆,打開開關(guān),小屏幕上將可出現(xiàn)測出的PH結(jié)果。PH如果7.6不足,小量的可用0.2M Na2HPO4調(diào)校,大量的可用氫氧化鈉調(diào)校。PH如果高于7.6,小量的用0.2M NaH2PO4調(diào)校,大量的可用HCL來調(diào)校。
②用試紙來測試:PH試紙有兩種,一種為廣泛PH試紙,范圍在1-14,另一種是精密試紙有各種各樣的范圍。但是,作為沖洗切片用的PBS,其度不需要十分,如配PH7.6時,測試時在PH7.5或7.7,都可使用。試紙測試PH值,停靠其反應(yīng)的顏色來確定,十分簡便,一般的試劑都可用它來測試。
③儀器測試:對于要求較高,需較準確的PH值,須彩用儀器測試。
1.Tris緩沖溶液(Tris buffer solution,TBS)
①1N HCL ,濃HCL(雙重1.19)8.3ml,先取50ml蒸餾水,加入HCL再加水到100ml。
②0.5M Tris-HCL緩沖液(PH7.6)
取Tris(羥甲基氨基甲烷)6.57g,加入少許的蒸餾水攪拌,直至溶解,再加入1N HCL42ml,然后用蒸餾水湊足100ml,于4℃冰箱保存。
臨用時,將上述溶液10稀釋倍,即為0.05M工作液。
注意事項:
①配制1N HCL時,如果大量配制,HCL入水時可產(chǎn)生很大的熱量,對的所用的玻璃器皿應(yīng)特別小心,以防突然產(chǎn)熱而使玻璃器皿爆裂。
②調(diào)校PH值時,可參考上述的三種方法
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